Wat is een polymerasekettingreactie (pcr)? feiten over test, stappen & gebruikt voor

Wat is PCR (polymerasekettingreactie)?

Polymerasekettingreactie (PCR) is een techniek die wordt gebruikt om sporen van DNA (en in sommige gevallen RNA) te amplificeren die zich in of op vrijwel elke vloeistof of oppervlak bevinden waar DNA-strengen kunnen worden afgezet. De sleutel tot het begrijpen van PCR is om te weten dat elke mens, dier, plant, parasiet, bacterie of virus genetisch materiaal bevat zoals DNA- (of RNA-) sequenties (nucleotidensequenties of stukjes DNA of RNA) die uniek zijn voor hun soort, en aan het individuele lid van die soort. Als een monster dus segmenten van DNA of RNA bevat, is PCR een methode die wordt gebruikt om deze unieke sequenties te amplificeren (veel meer identieke kopieën maken), zodat ze vervolgens met een zeer grote waarschijnlijkheid de identiteit van de bron (een specifieke persoon, dier of pathogeen organisme) van het sporen-DNA of RNA gevonden in of op vrijwel elk materiaalmonster.

PCR-amplificatie is echter slechts een deel van de identificatietest. Nadat de amplificatie is voltooid (zie hieronder), moeten de versterkte segmenten worden vergeleken met andere nucleotidesegmenten van een bekende bron (bijvoorbeeld een specifieke persoon, dier of pathogeen organisme). Deze vergelijking van unieke segmenten wordt vaak gedaan door PCR-gegenereerde nucleotidesequenties naast bekende nucleotidesequenties van mensen, pathogenen of andere bronnen in een scheidende gel te plaatsen. Elektrische stroom wordt door de gel geleid en de verschillende nucleotidesequenties vormen banden die lijken op een "ladder" volgens hun elektrische lading en moleculaire grootte. Dit wordt gelelektroforese genoemd. Banden of "ladder" -achtige stappen die naar dezelfde niveaus in de gel migreren, vertonen identiteit van nucleotidesequenties. Deze methode is een van de meest populaire manieren om PCR-tests uit te voeren (zie figuur 1).

Figuur 1, Banden of "ladder" -achtige stappen van PCR geproduceerd DNA van Mycobacterium (met dank aan de CDC)

Figuur. Repetitieve elementen (Rep) - PCR (A) en gepulseerde veldgelelektroforese (PFGE) (B) patronen van Mycobacterium cosmeticum isolaten van 2 patiënten in Ohio en 1 patiënt in Venezuela. Rep-PCR werd uitgevoerd met behulp van BOXA1R primer (3), en PFGE werd uitgevoerd met restrictie-enzym AseI. Lanen 1, 2, Ohio isoleert OH1 en OH2; banen 3, 4, controlestammen ATCC BAA-878T en ATCC BAA-879; baan 5, Venezolaanse isolaat VZ1. DNA-groottestandaarden zijn 100 bp (S1) en 48, 5 kb marker (S2).

Hoe wordt PCR (polymerasekettingreactie) gedaan?

In 1983 bedacht Kary Mullis de basisstappen om DNA-sequenties te amplificeren. Hij en Michael Smith ontvingen de Nobelprijs voor het ontwikkelen van deze procedure in 1993. Er zijn een paar basisstappen die achtereenvolgens worden gevolgd; PCR kan worden gedaan in een enkele buis met geschikte chemicaliën en een speciaal ontworpen verwarming. De benodigde reagentia of chemicaliën zijn als volgt:

• Een monster dat een nucleotidesequentie bevat (van bloed, haar, pus, huidschrapen, enz.)
• DNA-primers: kort enkelstrengig DNA dat zich hecht aan nucleotidesequenties die de synthese van een complementaire nucleotidenstreng bevorderen
• DNA-polymerase: een enzym dat, wanneer het DNA een primer heeft gebonden, door het DNA-segment gaat en DNA-bouwstenen verbindt om complementaire basenparen te vormen en zo een complementaire nucleotide-streng van DNA synthetiseert (de introductie van een hittebestendige DNA-polymerase, Taq polymerase, afgeleid van hittebestendige bacteriën, verbeterde het vermogen om PCR uit te voeren aanzienlijk)
• Een grote overmaat DNA-bouwstenen die nucleotiden worden genoemd (Adenine, Thymidine, Cytosine en Guanine, afgekort als respectievelijk A, T, C en G) zijn aanwezig in de oplossing. Wanneer deze blokken aan elkaar zijn gekoppeld, vormen ze een nucleotidesequentie of een enkele DNA-streng. Wanneer deze bouwstenen hun complementaire bouwsteen binden door zwakke waterstofbruggen (A zal bijvoorbeeld alleen binden met T en G alleen met C), wordt een complementaire DNA-nucleotidesequentie gevormd en gebonden aan het oorspronkelijke enkelstrengige DNA. Wanneer de binding is voltooid, wordt een complementair dubbelstrengs DNA gevormd in een specifieke volgorde.

PCR begint dan met een DNA-segment van een monster dat in een buis wordt geplaatst met de hierboven genoemde reagentia. De oplossing wordt verwarmd tot ten minste 94 ° C (201, 2 F); deze warmte breekt de waterstofbruggen waardoor complementaire DNA-strengen kunnen worden gevormd, dus bestaan ​​er alleen enkele strengen in het mengsel (dit wordt denaturatie van dubbelstrengs DNA genoemd).

Het mengsel wordt afgekoeld tot ongeveer 54 ° C (129, 2 F). Bij deze temperatuur binden de DNA-primers en DNA-polymerase aan individueel enkelstrengs DNA (dit wordt gloeien van het DNA genoemd). Omdat de bouwstenen in overmaat zijn (hoge concentratie) in het mengsel, gebruikt het polymerase ze om nieuwe complementaire DNA-strengen te maken (verlenging van het DNA genoemd) en dit proces is sneller bij 72 ° C (161, 6 F). Dit proces creëert een nieuw dubbelstrengs DNA-molecuul uit elk van de afzonderlijke strengen van het oorspronkelijke molecuul.

Deze cyclus wordt ongeveer 40 keer herhaald in een machine die een thermische cycler wordt genoemd die automatisch de verwarmings- en koelcycli herhaalt, waarbij de hoeveelheid van elke DNA-reeks verdubbelt telkens wanneer de verwarmings- en koelcyclus is voltooid. Wat aanvankelijk een enkel kort segment van DNA was, kan na 40 verdubbelingscycli worden versterkt tot ongeveer 100 miljard exemplaren.

Waarom zou een arts een PCR-test (polymerasekettingreactie) bestellen?

De PCR-test vormt de basis van een aantal tests die veel verschillende medische vragen kunnen beantwoorden die artsen helpen bij het diagnosticeren en behandelen van patiënten. PCR-tests kunnen bijvoorbeeld pathogene organismen bij patiënten detecteren en identificeren, met name die moeilijk te kweken zijn (bijvoorbeeld HIV en andere virussen en bepaalde schimmels).

Andere artsen bestellen PCR-tests om genetische ziekten te diagnosticeren, terwijl andere artsen PCR gebruiken om biologische relaties op te sporen, zoals het identificeren van ouders van kinderen. PCR-tests worden ook gebruikt om genetische mutaties en herschikkingen in bepaalde kankers te identificeren en te karakteriseren.

PCR-tests zijn echter gewijzigd en uitgebreid tot vele aspecten van wetenschappelijk onderzoek, waaronder evolutionaire biologie, genetische vingerafdrukken, forensisch onderzoek en vele andere.

Wat is RT-PCR?

RT-PCR is een PCR-test die is ontworpen om RNA te detecteren en te meten. Hoewel initiële PCR-testen DNA versterkten, gebruiken veel virussen en andere biologische componenten (bijvoorbeeld mitochondria) RNA als hun genetisch materiaal. RT-PCR verschilt van conventionele PCR door eerst RNA te nemen en de RNA-streng om te zetten in een DNA-streng. Dit wordt gedaan met in wezen dezelfde methode voor PCR die hierboven is beschreven, met uitzondering van het gebruik van een enzym genaamd reverse transcriptase in plaats van de DNA-polymerase. De reverse transcriptase maakt het mogelijk om een ​​enkele RNA-streng te vertalen in een complementaire DNA-streng. Zodra die reactie optreedt, kan de routinematige PCR-methode worden gebruikt om het DNA te amplificeren. RT-PCR is gebruikt om vele RNA-virussen te detecteren en te bestuderen.

RT-PCR moet niet worden verward met een andere variatie van PCR, Real-Time PCR genoemd. Real-time PCR is een variatie van PCR die analyse van het geamplificeerde DNA gedurende de gebruikelijke 40 cycli van de procedure mogelijk maakt. Hoewel de procedure vergelijkbaar is met conventionele PCR met cycli, maakt Real-Time PCR gebruik van fluorescerende kleurstoffen die aan sommige van de bouwstenen of kleine nucleotidestrengen zijn bevestigd. Afhankelijk van de gebruikte methode treedt fluorescentie op wanneer de geamplificeerde DNA-strengen worden gevormd. De hoeveelheid fluorescentie kan gedurende de 40 cycli worden gemeten en stelt de onderzoekers in staat om specifieke producten en hun hoeveelheden te meten tijdens de amplificatiecycli. Hierdoor kunnen onderzoekers of laboratoriumtechnici vaak de gelelektroforese of andere secundaire procedures die nodig zijn voor de analyse van de PCR-producten overslaan, waardoor snellere resultaten worden geproduceerd.

Real-time PCR en RT-PCR zijn variaties of aanpassingen van de originele PCR-test. Er zijn echter veel meer variaties (minstens 25) die bestaan ​​en worden gebruikt om specifieke problemen op te lossen. Ze hebben allemaal verschillende namen zoals Assemblage-PCR, Hot-start-PCR, Multiplex-PCR, Solid-phase PCR en vele anderen.

PCR zal waarschijnlijk verder worden aangepast om eventuele andere vragen in de geneeskunde, biologie te helpen beantwoorden. en andere vakgebieden.